Нашли методу на раннюю с поздней адаптацию

Нашли методу на раннюю с поздней адаптацию
Штатовские ученые определили по новой методике индивидуального генетического штрих-кодирования, что ранние этапы адаптации предсказуемы, поздние — случайны
«Новая методика индивидуального генетического «штрих-кодирования» позволила американским ученым в деталях изучить процесс накопления полезных мутаций в большой бесполой популяции дрожжей в ходе адаптации к новой среде. Как выяснилось, на начальных этапах общий рост приспособленности популяции идет в основном за счет высоковероятных мутаций со слабым положительным эффектом, которые возникают независимо у множества особей. На этой стадии процесс адаптации во многом предсказуем. В дальнейшем роль случайности возрастает, потому что на первый план выходят маловероятные мутации с сильным полезным эффектом.
Задача количественного описания эволюции больших бесполых популяций имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Большие, быстро эволюционирующие популяции одноклеточных паразитов, будь то болезнетворные бактерии или раковые клетки, ежегодно уносят жизни примерно 20 миллионов людей (около 30% всех смертей на планете). Чтобы сдерживать эту угрозу, важно знать, какие факторы влияют на рост приспособленности клонально размножающихся одноклеточных и как можно этот рост затормозить.
В популяциях, насчитывающих миллионы особей, в каждом поколении возникает множество новых мутаций, в том числе — «полезных», то есть ускоряющих размножение. Все они вносят вклад в общую приспособленность популяции, от которой зависит скорость ее роста. Но как уследить за тысячами мутаций, происходящими у миллионов особей? Секвенировать целиком миллионы геномов — неподъемная задача даже при современном уровне развития биотехнологий. Если же применять выборочное полногеномное секвенирование, то в поле зрения исследователей попадут только мутации, достигшие высокой численности (частоты встречаемости). Это может существенно исказить картину. Ведь большинство возникающих в бесполой популяции полезных мутаций, возможно, никогда не становятся массовыми, но свой вклад в общую приспособленность они, тем не менее, вносят.
Альтернативный подход состоит в том, чтобы пометить отдельные клоны (клетки, произошедшие от одной и той же родительской клетки) наследуемой меткой, а потом следить, как меняется численность клона. Если она вдруг начала экспоненциально расти (см. Exponential growth), в то время как общая численность популяции остается постоянной, значит, у одного из представителей клона возникла полезная мутация. При этом скорость экспоненциального роста является мерой полезности мутации. Например, если рост численности клона описывается уравнением N = N0·(1 + 0,05)t, где время (t) измеряется в поколениях, то мутация повысила приспособленность на 5% (полезность мутации s = 0,05).
Новая статья американских биологов, опубликованная на сайте журнала Nature, демонстрирует важный прорыв в развитии методов наблюдения за эволюцией многомиллионных бесполых популяций. Авторы работали с популяциями дрожжей, в которых были помечены индивидуальными генетическими метками по 500 000 индивидуальных клонов. Для этого была изготовлена большая коллекция плазмид, содержащих случайные двадцатинуклеотидные последовательности (генетический «штрих-код»). Эти плазмиды внедрялись в дрожжевые клетки, геномы которых были предварительно модифицированы таким образом, чтобы плазмиды встраивались в строго определенное место генома при помощи Cre-рекомбиназы (см. Cre recombinase). Кроме того, у подопытных дрожжей была удалена и перенесена в плазмиды часть гена URA3. Это позволило исследователям отобрать те дрожжевые клетки, у которых встраивание плазмиды прошло успешно (только у этих клеток ген URA3 нормально работал, и поэтому они могли расти в среде, не содержащей урацила или уридина (см. Uridine)).
В итоге авторы получили две подопытные популяции дрожжей численностью по 108 особей каждая, происходящие от одной предковой клетки. В обеих популяциях каждая клетка принадлежала к одному из полумиллиона помеченных клонов. Эти популяции затем в течение 168 поколений адаптировались к «голодной» среде, где размножение ограничивалось количеством глюкозы.
Численность каждого клона отслеживалась путем массового секвенирования небольшого фрагмента генома, содержащего штрих-код. Секвенировать приходилось лишь 0,002% генома, что позволило резко увеличить «частотное разрешение» метода по сравнению с полногеномным секвенированием. В поле зрения исследователей попали даже те мутации, частота встречаемости которых в популяции никогда не превышала 10–5, тогда как секвенирование полных геномов позволило бы отследить лишь клоны с относительной численностью от 10–2 и выше. В результате вместо 25 000 зарегистрированных мутаций исследователям удалось бы обнаружить лишь около 15.
Впрочем, даже зная численность каждого клона в разные моменты времени, определить, в каком из них возникла полезная мутация — не такая простая задача. Каждая мутация возникает сначала у одной особи. Пока число потомков удачного мутанта невелико, динамика их численности определяется не столько приспособленностью (отбором), сколько случайными колебаниями (дрейфом). Большая часть вновь возникающих полезных мутаций теряется из-за дрейфа: потомки удачного мутанта просто не успевают достичь такой численности, при которой отбор «заметит» их полезную мутацию и начнет ее поддерживать. Мутация становится заметна для отбора (и выходит из-под власти дрейфа) лишь по достижении численности, сопоставимой с 1/s. Например, мутация, повышающая приспособленность на 1%, становится заметна для отбора при числе мутантов около 100. Мутантному клону должно повезти, чтобы его численность за счет дрейфа доросла до этого порога — лишь тогда за дело возьмется отбор, а мутацию можно будет считать «установившейся» (established). Такая мутация, если она полезна, уже не потеряется из-за случайного дрейфа.
После того как мутация «установилась», численность клона будет экспоненциально расти. По скорости роста можно оценить полезность мутации (s), а экстраполируя тренд в прошлое, можно примерно определить время возникновения мутации (τ). Впрочем, этот удобный для количественного анализа период в истории клона будет продолжаться лишь до тех пор, пока в геноме, уже содержащем одну полезную мутацию, не возникнет вторая. После этого все расчеты оказываются резко затруднены и картина смазывается. Именно поэтому рассматриваемая методика позволяет анализировать лишь начальные этапы адаптации — до тех пор, пока вероятность возникновения повторных полезных мутаций остается пренебрежимо малой (а она перестает быть таковой, когда численность клона приближается к 1/Ub, где Ub — вероятность возникновения полезной мутации в расчете на особь за одно поколение).
Авторы использовали множество сложных статистических приемов и компьютерное моделирование, чтобы учесть все эти и многие другие методологические трудности. В итоге они пришли к следующим выводам.
Численность большинства клонов снижалась в ходе эволюционного эксперимента, нередко — до полного вымирания. Такая судьба характерна для «нейтральных» клонов, в которых не возникло полезных мутаций. Однако примерно у 5% клонов (25 000 из 500 000) за первую сотню поколений появилась и «установилась» полезная мутация (красные линии). Речь идет о 100 поколениях, а не о всех 168, потому что полезные мутации, появившиеся на поздних этапах эволюционного эксперимента, не могли быть зарегистрированы при помощи применявшихся методик: эти поздние мутации просто не успевали набрать достаточную численность за время, оставшееся до конца эксперимента.
По мере размножения клеток, обладающих полезными мутациями, средняя приспособленность популяции росла. Это, в свою очередь, приводило к тому, что «нейтральные» клоны, в которых не было полезных мутаций, а приспособленность осталась на исходном уровне, оказывались во всё более проигрышном положении. Их численность продолжала убывать. Более того, многие «удачливые» клоны, поначалу бодро размножавшиеся благодаря рано возникшей слабополезной мутации, в дальнейшем приходили в упадок и начинали вымирать. Это объясняется тем, что на фоне возросшей приспособленности конкурентов их полезная мутация уже не давала преимущества. Средняя приспособленность популяции за 100 поколений выросла примерно на 5%. Соответственно, к этому времени все обладатели мутаций с s < 0,05 оказались в проигрыше, хотя на ранних этапах адаптации именно эти многочисленные клоны оказывали определяющее влияние на общий рост приспособленности.
Эти результаты говорят о том, что ключевым процессом, определяющим динамику адаптации в большой бесполой популяции является безжалостная конкуренция между клонами — обладателями разных полезных мутаций (клональная интерференция, см. Clonal interference). При этом ранние стадии адаптации определяются в основном высоковероятными и потому многочисленными слабополезными мутациями. Таких мутаций, повышающих приспособленность на 2–5% (0,02 < s < 0,05, мутации с более слабым эффектом остались незамеченными) в первой из двух подопытных популяций установилось около 20 000, во второй — 11 000. На этом этапе ход адаптации в значительной мере предсказуем: его можно описать уравнениями, и при повторных эволюционных экспериментах результаты получаются схожими. Затем, по мере роста средней приспособленности, многочисленные слабополезные мутации фактически перестают быть полезными и начинают отбраковываться. Продолжает нарастать лишь численность тех немногих клонов, в которых возникли редкие мутации с сильным положительным эффектом. К 70-му поколению динамика общей приспособленности определялась в основном мутациями с величиной s около 0,1; таких мутаций в двух подопытных популяциях было, соответственно, 5000 и 3000. После 110-го поколения на первый план вышли примерно по 100 клонов с наиболее полезными мутациями (s > 0,1). На этом этапе ход адаптации становится всё менее предсказуемым, поскольку то, в какие моменты и в каком количестве возникнут в популяции эти маловероятные мутации, зависит от случая.
Внимательный читатель может заметить кажущееся противоречие между этими результатами и теми, которые были получены в долгосрочном эволюционном эксперименте Ричарда Ленски. Там сначала закреплялись мутации с сильным положительным эффектом, и лишь затем начинали фиксироваться мутации, ненамного повышавшие приспособленность. На самом деле расхождений тут нет, просто речь идет о разном временном масштабе изучаемых процессов и о разных этапах адаптации (у Ленски — 50 000 поколений, в рассматриваемой работе — 168), а также о разных отслеживаемых параметрах и разной разрешающей способности методов. В работе Ленски отслеживались в основном зафиксировавшиеся, то есть достигшие 100-процентной частоты полезные мутации, а в рассматриваемой работе речь идет лишь об «установившихся» мутациях, подавляющее большинство которых никогда не зафиксируется, а будет вытеснено в ходе клональной интерференции. Те мутации, которые зафиксировались бы в итоге у подопытных дрожжей (если бы эксперимент продлился еще несколько сотен поколений), были бы как раз мутациями с сильным положительным эффектом, как и в эксперименте Ленски. Новое исследование раскрыло тонкие детали начальных этапов адаптации. В частности, оно объяснило, почему многочисленные слабополезные мутации поначалу не имеют шанса зафиксироваться: они будут неизбежно отбраковываться по мере роста общей приспособленности популяции.
Авторы оценили также общую частоту возникновения полезных мутаций у подопытных дрожжей после того, как их поместили в «голодные» условия. Полезная мутация с s > 0,05 возникает в такой ситуации с частотой 10–6 на клетку за поколение. Приняв во внимание базовую частоту мутирования исходного штамма (4·10–10 на нуклеотид за поколение), авторы рассчитали ту долю неповторяющихся частей генома, изменения в которой в данных условиях повышают приспособленность на 5 и более процентов. Эта доля оказалась равной 0,04% (5000 нуклеотидов). Это примерно соответствует оценкам, полученным ранее другими авторами. Впрочем, данная цифра сильно зависит от условий, к которым нужно приспосабливаться. Понятно, что если поместить дрожжи в идеальные для них условия, то вероятность того, что случайная мутация окажется полезной, будет крайне низка. Трудно что-то улучшить, когда и так всё прекрасно (см. Принцип Анны Карениной). Соответственно, в плохих условиях эта вероятность будет выше.
Многие теоретики предполагали, что частота возникновения мутаций с тем или иным значением s (μ(s)) должна экспоненциально убывать по мере роста s. Полученные результаты не подтвердили эту гипотезу. Хотя μ действительно снижается с ростом s, это снижение не похоже на монотонную экспоненту. Например, оно резко замедляется в диапазоне s от 0,08 до 0,10, так что график на этом участке почти выходит на плато. Авторы предполагают (и приводят ряд статистических аргументов в пользу своего предположения), что плато соответствует одному конкретному классу мутаций, а именно мутациям, отключающим или выводящим из строя тот или иной ген, работа которого в новых условиях не идет на пользу организму. Известно, что такие мутации нередко оказываются полезными и закрепляются на самых ранних этапах адаптации к новым условиям.
Исследование наглядно показало, что «генетическое штрих-кодирование» позволяет изучать ранние этапы адаптации больших бесполых популяций с очень высоким разрешением, замечая полезные мутации, частота которых не достигает даже сотых долей процента. К важнейшим и относительно неожиданным результатам относится вывод о том, что начальный рост общей приспособленности популяции обусловлен в основном теми полезными мутациями, которым не суждено достичь высоких частот и которые вскоре будут вытеснены. Таких мутаций оказалось неожиданно много.
Недостатком метода является неизбежное снижение разнообразия штрих-кодов в популяции со временем. Из-за этого метод пока пригоден только для анализа самых ранних этапов адаптации. Но это ограничение можно преодолеть, если научиться добавлять в популяцию новые штрих-коды по мере необходимости,- повествуется в материале на сайте «Элементов».